科研指南
Research Guide
01
Native Western Blot protocol
Princle:
Native PAGE uses the same discontinuous chloride and glycine ion fronts as SDS-PAGE to form moving boundaries that stack and then separate polypeptides by charge to mass ratio. Proteins are prepared in a non-reducing non-denaturing sample buffer, which maintains the proteins’ secondary structure and native charge density. Therefore you can easily see multiple bands from the camshot of your native PAGE gel if your target protein has polymerized forms in your sample. In native PAGE electrophoresis most proteins have an acidic or slightly basic pl (isoelectric point) (~3–8) and migrate towards the negative polar. If your protein's pl is larger than 8,9, for example, you should probably reverse the anode and run the native PAGE gel.
Gel running protocol:
1. Prepare appropriate amount of separating gel in a small beaker, then add specific vol. of AP and TEMED and gently swirl the beacker to ensure a sufficient mixing. Pipet the gel solution into the gap between the glass plates of gel casting (Don't fully fill). Fill the rest space with water (isopropanol alternatively). Allow 20-30min for a complete gelation.
2. You can prepare the stacking gel solution while the separating gel is gelating. Prepare appropriate amount of stacking gel in a beacker and mix with 10% AP and 1% TEMED. Pour out the water in the first step and pipet the stacking gel solution into the gap and insert the comb. Allow 20-30min to let it gelate.
3. Mix your sample with sample buffer. Do not heat your sample!
4. Load the sample mixture and set an appropriate voltage to run the electrophoresis.
Note:
It's better to put the system on ice and not set a relative high Volt in case the proteins degrade.
In native PAGE electrophoresis most proteins have an acidic or slightly basic pl (isoelectric point) (~3–8) and migrate towards the negative polar. If your protein's pl is larger than 8,9, for example, you should probably reverse the anode and run the native PAGE gel.
5. Stain as you would a standard Coomassie-blue protocol or proceed to a immuno-blotting procedure (western-blot).
Native PAGE uses the same discontinuous chloride and glycine ion fronts as SDS-PAGE to form moving boundaries that stack and then separate polypeptides by charge to mass ratio. Proteins are prepared in a non-reducing non-denaturing sample buffer, which maintains the proteins’ secondary structure and native charge density. Therefore you can easily see multiple bands from the camshot of your native PAGE gel if your target protein has polymerized forms in your sample. In native PAGE electrophoresis most proteins have an acidic or slightly basic pl (isoelectric point) (~3–8) and migrate towards the negative polar. If your protein's pl is larger than 8,9, for example, you should probably reverse the anode and run the native PAGE gel.
Gel running protocol:
1. Prepare appropriate amount of separating gel in a small beaker, then add specific vol. of AP and TEMED and gently swirl the beacker to ensure a sufficient mixing. Pipet the gel solution into the gap between the glass plates of gel casting (Don't fully fill). Fill the rest space with water (isopropanol alternatively). Allow 20-30min for a complete gelation.
2. You can prepare the stacking gel solution while the separating gel is gelating. Prepare appropriate amount of stacking gel in a beacker and mix with 10% AP and 1% TEMED. Pour out the water in the first step and pipet the stacking gel solution into the gap and insert the comb. Allow 20-30min to let it gelate.
3. Mix your sample with sample buffer. Do not heat your sample!
4. Load the sample mixture and set an appropriate voltage to run the electrophoresis.
Note:
It's better to put the system on ice and not set a relative high Volt in case the proteins degrade.
In native PAGE electrophoresis most proteins have an acidic or slightly basic pl (isoelectric point) (~3–8) and migrate towards the negative polar. If your protein's pl is larger than 8,9, for example, you should probably reverse the anode and run the native PAGE gel.
5. Stain as you would a standard Coomassie-blue protocol or proceed to a immuno-blotting procedure (western-blot).
02
WB常见问题解答
wb实验中检测到的条带大小与预测的条带大小不一致？
1）首先确认一下样品是内源性蛋白还是重组蛋白，如果是重组蛋白是否为全长序列？如果不是全长的序列一定会与预测条带大小不一致；
2）查看NCBI或SWISSPROT确认目标蛋白是否有翻译后的修饰，例如糖基化，磷酸化；通常翻译后的修饰可能会增加蛋白的分子量大小；
3）查看swissprot或者权威的paper确认目标蛋白是否有可能发生剪切活化；
4）查看SWISSPROT确认目标蛋白是否有多个isoform；
5）目标蛋白是否为二聚体或者多聚体形式；
wb实验中推荐的样本上样量是多少？
1）全细胞裂解物，膜提取物，核提取物建议每孔上20-30ug；
2）重组蛋白建议10-100ng/lane;
如何根据蛋白定位选择适合的裂解液？
1）全细胞蛋白或者膜蛋白： NP40或者RIPA；
2）细胞核或者线粒体： RIPA或者相应的商业化裂解液；
封闭液选择BSA还是milk？
1）一般说来，BSA不像milk成分复杂，因此通常封闭效果较好；
2）个别的抗体用milk的封闭效果会更好，说明书上通常会有提示；
3）如果是oddessey检测系统，不建议使用BSA封闭，通常用milk或者lico的blocking buffer；
如何选取阳性对照？
1）首先检查抗体使用说明书上推荐的positive control；
2）对于抗体说明书上没有推荐阳性对照的，参考abreview中成功检测的组织或者细胞；
3）pubmed上查找文献确认适合的lysate作为阳性对照；
分子量大于100kd的蛋白wb实验中有哪些注意事项？
1）转膜缓冲液中添加终浓度为0.1%的SDS，同时降低甲醇的浓度到10%；
2）延长转膜时间；例如400-500kd分子量建议200V转4-6h；
3）立春红转膜确认转膜效率；
4) 使用0.45um的膜；
跨膜蛋白wb实验中注意事项？
对于多次跨膜的蛋白由于煮沸可能导致蛋白的聚集不容易被分出来，建议70度煮10mins，对于跨膜次数特别多的可以考虑37度15mins；
什么时候做不加一抗对照？
wb结果遇到高背景或者有杂带，设置不加一抗的对照可以判断非特异性的结合是否来自于二抗；
组织或者细胞裂解时一般加多少体积的裂解液？
1）通常1X107 cells加1ml预冷的lysis buffer；4度30mins；
2）5mg组织加300ul预冷的lysis buffer；4度2hr；
如何验证磷酸化抗体的特异性？
1）转膜后的PVDF膜在1% calf intestinal alkaline phosphatase diluted in NE buffer 1 (NaCl 10 mM; Tris 5mM, pH 7.9; MgCl2 1 mM; dithiothreitol 0.1 mM)37度孵育过夜；
2）TBST洗涤3次；
3）5%milk封闭；
4）一抗孵育过夜；
5）常规的洗涤，二抗孵育等；
如何用封闭肽验证抗体的特异性？
样本染色步骤之前，将抗体与对应的封闭肽先孵育，再做抗体染色的步骤，结果应该是阴性的；
同时应该平时设置不加封闭肽的对照，应该是有特异性的阳性结果；
封闭肽验证抗体的特异性的具体步骤如何？
1）准备两管稀释好的抗体（例如 0.5 µg/mL，2ml，需要加1ug antibdoy）
2）标记blocked的vial里加入相应于抗体质量5倍的peptide（例如1ug抗体的buffer里加5ugpeptide）；标记control的vial里加等量的buffer；
3）室温孵育30min或者4度过夜；
4）分别做下边的染色步骤；
5）标记blocked的vial应该是阴性的结果；control的vial是对应的特异性的阳性结果；
wb实验中没有信号条带可能的原因？
1）样本里是否含有目标蛋白；目标蛋白的表达丰度是否在检测范围之内；
2）一抗和二抗是否匹配？
2）一抗和二抗的浓度是否足够？
4）检查抗体是否能够识别样本种鼠中的目标蛋白？
5）目标蛋白是否有效的转移到膜上；最好立春红染膜，确认转膜效率；
6）洗涤次数是否过多， 一般3-5次，每次5分钟；
7）是否重复使用稀释过的抗体？
8）二抗是否可以正常的工作；
9）底物是否有效；
wb实验中高背景可能的原因?
1)封闭液不适合？改变封闭液的类型，常用的封闭液是BSA， milk；
2）一抗浓度或者二抗浓度过高；
3）孵育温度太高了；建议4度过夜；或者室温1-2h；
4）二抗的非特异性结合；设置不加一抗的对照确认是否二抗的非特异性结合引起；
5）封闭液与一抗或者二抗有交叉反应；例如磷酸化的抗体不能用milk作为封闭液， milk中含有casein， casein是磷酸化的蛋白，因此可能会与一抗产生交叉反应；
6）洗涤不充分；通常短时间多次洗涤效果要优于长时间的少次洗涤；
7）膜是否变干？
多条带可能的原因？
1）细胞传代次数过多，累计了很多差异；以没有传代的细胞系设置平行对照；
2）目标蛋白有很多种修饰，例如acetylation, methylation,
myristylation, phosphorylation, glycosylation etc.查阅文献并使用去修饰的试剂验证；
3）目标蛋白是否被降解了？
4）目标蛋白是否有剪切活化的形式；
5）一抗浓度和二抗浓度是否太高；
6）是否为非特异性条带；
7）目标蛋白是否有二聚体或者多聚体形式；电泳前延长煮沸时间到10mins；loading buffer里含有还原剂；
膜上有不均一白点
1）转膜时有胶与膜之间有气泡；
2）抗体孵育时不均匀；
膜上有黑点
抗体与封闭试剂结合；
分子量marker是黑色
1）抗体与marker有交叉反应；在marker与sample增加一个blank lane；
膜上有微笑效应
1）电泳迁移太快了；降低电泳时的电压；
2）电泳时太热了；电泳时在低温环境下；
染色不均匀
1）试剂被细菌污染了；抗体保存在4度或者-20度，buffer新鲜配置；
2）抗体量太少，不足以完全覆盖膜；
如何有效的提取组蛋白？
1）收集细胞，遇冷PBS洗涤；
2）TEB(TEB: PBS containing 0.5% Triton X 100 (v/v), 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.02% (w/v) NaN3)重悬细胞；107 cells/ml；
3）冰上裂解10mins；
4） 6,500 x g for 10 min at 4°C to spin down the nuclei，去上清；
5）一半体积的TEB洗涤nuclei；
6）0.2 N HCl 重悬细胞，4度过夜抽提组蛋白；4x107 nuclei per ml；
7）6,500 x g for 10 min at 4°C，保留上清；即为组蛋白提取物；
PVDF膜和NC膜的区别？
NC膜：
（1）与蛋白的结合能力：80-100μg/cm2；
（2）膜的孔径：0.45um，适用于>20kd的蛋白；0.2um：适合大于7kd，小于20kd的蛋白；0.1um：适合于小于7kd的蛋白；
（3）NC膜使用前无需使用甲醇活化；只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；
（4）封闭液时尽量使用较温和的tween-20（例如0.05%）
PVDF膜：
（1）与蛋白的结合能力：100-200μg/cm2
（2）更好的机械强度和化学耐受性；
（3）100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡；
（4）PVDF膜同样分0.45um和0.2um的
小于10KD的蛋白电泳时建议的胶类型？
4-20% Tris Glycine gel.
WB试验如何选择亚细胞组分的loading control?
Histone H3 Nuclear Loading Control
COX IV Mitochondrial Loading Control
Sodium Potassium ATPase Plasma Membrane Loading Control
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid= 11403#B5
非变性非还原电泳如何配胶以及buffer？
非还原SDS处理：凝胶加样缓冲液中只加入SDS，而不加DTT或者巯基乙醇等还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为天然电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下进行电泳和配胶,电泳缓冲液凝胶，加样缓冲液都没有SDS 。凝胶加样缓冲液中无DTT
一般我们说明书不特地指明的都要求变性且还原。
关于重组蛋白的修饰水平
1）酵母：蛋白天然结构会有一些差异，修饰化水平很低
2）昆虫：产物的抗原性，免疫原性以及功能与天然蛋白接近。但修饰水平不够准确。
3）哺乳动物细胞系：产物的抗原性，免疫原性以及功能与天然蛋白最接近。修饰加工最准确。
修饰对蛋白分子量的影响
糖基化： 10kDa的蛋白带一个2k的N-糖链有可能在SDS-PAGE上的电泳速度和20KDa无糖基化的差不多。
cardic actin and skelekal actin
cardia= actc1 skelekal=acta1 pan actin= actc1+ acta1 （CCE 7220708 ）
预测分子量大小以及PI
http://web.expasy.org/compute_pi/
关于native gel
1）http://www.assay-protocol.com/molecular- biology/electrophoresis/native-page
2）http://www.assay-protocol.com/antibody
3）Bio-rad ss: Bio rad 有不含SDS的预制胶，另外running
buffer是tris-glycerine,pH 8.3 如果目标蛋白的pH 大于8.3建议翻转电极来跑
actin的分类
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α- smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin； 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。
F-actin 与G-actin的区别
F-actin是G-actin聚集在一起形成的丝状结构， G-actin可能是α,β,γ型的。 F-actin与G-actin是相对的两种存在形式。而α,β,γ是三种相对的物质，虽然差别及其小。在western
中，一般用的是β-actin，但并不是所有的都适合。 western中鉴定的一般都是G-actin。因为SDSPAGE后的胶中应该只有单体的actin，也就是G-actin。
1）首先确认一下样品是内源性蛋白还是重组蛋白，如果是重组蛋白是否为全长序列？如果不是全长的序列一定会与预测条带大小不一致；
2）查看NCBI或SWISSPROT确认目标蛋白是否有翻译后的修饰，例如糖基化，磷酸化；通常翻译后的修饰可能会增加蛋白的分子量大小；
3）查看swissprot或者权威的paper确认目标蛋白是否有可能发生剪切活化；
4）查看SWISSPROT确认目标蛋白是否有多个isoform；
5）目标蛋白是否为二聚体或者多聚体形式；
wb实验中推荐的样本上样量是多少？
1）全细胞裂解物，膜提取物，核提取物建议每孔上20-30ug；
2）重组蛋白建议10-100ng/lane;
如何根据蛋白定位选择适合的裂解液？
1）全细胞蛋白或者膜蛋白： NP40或者RIPA；
2）细胞核或者线粒体： RIPA或者相应的商业化裂解液；
封闭液选择BSA还是milk？
1）一般说来，BSA不像milk成分复杂，因此通常封闭效果较好；
2）个别的抗体用milk的封闭效果会更好，说明书上通常会有提示；
3）如果是oddessey检测系统，不建议使用BSA封闭，通常用milk或者lico的blocking buffer；
如何选取阳性对照？
1）首先检查抗体使用说明书上推荐的positive control；
2）对于抗体说明书上没有推荐阳性对照的，参考abreview中成功检测的组织或者细胞；
3）pubmed上查找文献确认适合的lysate作为阳性对照；
分子量大于100kd的蛋白wb实验中有哪些注意事项？
1）转膜缓冲液中添加终浓度为0.1%的SDS，同时降低甲醇的浓度到10%；
2）延长转膜时间；例如400-500kd分子量建议200V转4-6h；
3）立春红转膜确认转膜效率；
4) 使用0.45um的膜；
跨膜蛋白wb实验中注意事项？
对于多次跨膜的蛋白由于煮沸可能导致蛋白的聚集不容易被分出来，建议70度煮10mins，对于跨膜次数特别多的可以考虑37度15mins；
什么时候做不加一抗对照？
wb结果遇到高背景或者有杂带，设置不加一抗的对照可以判断非特异性的结合是否来自于二抗；
组织或者细胞裂解时一般加多少体积的裂解液？
1）通常1X107 cells加1ml预冷的lysis buffer；4度30mins；
2）5mg组织加300ul预冷的lysis buffer；4度2hr；
如何验证磷酸化抗体的特异性？
1）转膜后的PVDF膜在1% calf intestinal alkaline phosphatase diluted in NE buffer 1 (NaCl 10 mM; Tris 5mM, pH 7.9; MgCl2 1 mM; dithiothreitol 0.1 mM)37度孵育过夜；
2）TBST洗涤3次；
3）5%milk封闭；
4）一抗孵育过夜；
5）常规的洗涤，二抗孵育等；
如何用封闭肽验证抗体的特异性？
样本染色步骤之前，将抗体与对应的封闭肽先孵育，再做抗体染色的步骤，结果应该是阴性的；
同时应该平时设置不加封闭肽的对照，应该是有特异性的阳性结果；
封闭肽验证抗体的特异性的具体步骤如何？
1）准备两管稀释好的抗体（例如 0.5 µg/mL，2ml，需要加1ug antibdoy）
2）标记blocked的vial里加入相应于抗体质量5倍的peptide（例如1ug抗体的buffer里加5ugpeptide）；标记control的vial里加等量的buffer；
3）室温孵育30min或者4度过夜；
4）分别做下边的染色步骤；
5）标记blocked的vial应该是阴性的结果；control的vial是对应的特异性的阳性结果；
wb实验中没有信号条带可能的原因？
1）样本里是否含有目标蛋白；目标蛋白的表达丰度是否在检测范围之内；
2）一抗和二抗是否匹配？
2）一抗和二抗的浓度是否足够？
4）检查抗体是否能够识别样本种鼠中的目标蛋白？
5）目标蛋白是否有效的转移到膜上；最好立春红染膜，确认转膜效率；
6）洗涤次数是否过多， 一般3-5次，每次5分钟；
7）是否重复使用稀释过的抗体？
8）二抗是否可以正常的工作；
9）底物是否有效；
wb实验中高背景可能的原因?
1)封闭液不适合？改变封闭液的类型，常用的封闭液是BSA， milk；
2）一抗浓度或者二抗浓度过高；
3）孵育温度太高了；建议4度过夜；或者室温1-2h；
4）二抗的非特异性结合；设置不加一抗的对照确认是否二抗的非特异性结合引起；
5）封闭液与一抗或者二抗有交叉反应；例如磷酸化的抗体不能用milk作为封闭液， milk中含有casein， casein是磷酸化的蛋白，因此可能会与一抗产生交叉反应；
6）洗涤不充分；通常短时间多次洗涤效果要优于长时间的少次洗涤；
7）膜是否变干？
多条带可能的原因？
1）细胞传代次数过多，累计了很多差异；以没有传代的细胞系设置平行对照；
2）目标蛋白有很多种修饰，例如acetylation, methylation,
myristylation, phosphorylation, glycosylation etc.查阅文献并使用去修饰的试剂验证；
3）目标蛋白是否被降解了？
4）目标蛋白是否有剪切活化的形式；
5）一抗浓度和二抗浓度是否太高；
6）是否为非特异性条带；
7）目标蛋白是否有二聚体或者多聚体形式；电泳前延长煮沸时间到10mins；loading buffer里含有还原剂；
膜上有不均一白点
1）转膜时有胶与膜之间有气泡；
2）抗体孵育时不均匀；
膜上有黑点
抗体与封闭试剂结合；
分子量marker是黑色
1）抗体与marker有交叉反应；在marker与sample增加一个blank lane；
膜上有微笑效应
1）电泳迁移太快了；降低电泳时的电压；
2）电泳时太热了；电泳时在低温环境下；
染色不均匀
1）试剂被细菌污染了；抗体保存在4度或者-20度，buffer新鲜配置；
2）抗体量太少，不足以完全覆盖膜；
如何有效的提取组蛋白？
1）收集细胞，遇冷PBS洗涤；
2）TEB(TEB: PBS containing 0.5% Triton X 100 (v/v), 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.02% (w/v) NaN3)重悬细胞；107 cells/ml；
3）冰上裂解10mins；
4） 6,500 x g for 10 min at 4°C to spin down the nuclei，去上清；
5）一半体积的TEB洗涤nuclei；
6）0.2 N HCl 重悬细胞，4度过夜抽提组蛋白；4x107 nuclei per ml；
7）6,500 x g for 10 min at 4°C，保留上清；即为组蛋白提取物；
PVDF膜和NC膜的区别？
NC膜：
（1）与蛋白的结合能力：80-100μg/cm2；
（2）膜的孔径：0.45um，适用于>20kd的蛋白；0.2um：适合大于7kd，小于20kd的蛋白；0.1um：适合于小于7kd的蛋白；
（3）NC膜使用前无需使用甲醇活化；只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；
（4）封闭液时尽量使用较温和的tween-20（例如0.05%）
PVDF膜：
（1）与蛋白的结合能力：100-200μg/cm2
（2）更好的机械强度和化学耐受性；
（3）100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡；
（4）PVDF膜同样分0.45um和0.2um的
小于10KD的蛋白电泳时建议的胶类型？
4-20% Tris Glycine gel.
WB试验如何选择亚细胞组分的loading control?
Histone H3 Nuclear Loading Control
COX IV Mitochondrial Loading Control
Sodium Potassium ATPase Plasma Membrane Loading Control
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid= 11403#B5
非变性非还原电泳如何配胶以及buffer？
非还原SDS处理：凝胶加样缓冲液中只加入SDS，而不加DTT或者巯基乙醇等还原剂，此时二硫键不能断裂，所以蛋白没有完全去折叠。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为天然电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下进行电泳和配胶,电泳缓冲液凝胶，加样缓冲液都没有SDS 。凝胶加样缓冲液中无DTT
一般我们说明书不特地指明的都要求变性且还原。
关于重组蛋白的修饰水平
1）酵母：蛋白天然结构会有一些差异，修饰化水平很低
2）昆虫：产物的抗原性，免疫原性以及功能与天然蛋白接近。但修饰水平不够准确。
3）哺乳动物细胞系：产物的抗原性，免疫原性以及功能与天然蛋白最接近。修饰加工最准确。
修饰对蛋白分子量的影响
糖基化： 10kDa的蛋白带一个2k的N-糖链有可能在SDS-PAGE上的电泳速度和20KDa无糖基化的差不多。
cardic actin and skelekal actin
cardia= actc1 skelekal=acta1 pan actin= actc1+ acta1 （CCE 7220708 ）
预测分子量大小以及PI
http://web.expasy.org/compute_pi/
关于native gel
1）http://www.assay-protocol.com/molecular- biology/electrophoresis/native-page
2）http://www.assay-protocol.com/antibody
3）Bio-rad ss: Bio rad 有不含SDS的预制胶，另外running
buffer是tris-glycerine,pH 8.3 如果目标蛋白的pH 大于8.3建议翻转电极来跑
actin的分类
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α- smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin； 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。
F-actin 与G-actin的区别
F-actin是G-actin聚集在一起形成的丝状结构， G-actin可能是α,β,γ型的。 F-actin与G-actin是相对的两种存在形式。而α,β,γ是三种相对的物质，虽然差别及其小。在western
中，一般用的是β-actin，但并不是所有的都适合。 western中鉴定的一般都是G-actin。因为SDSPAGE后的胶中应该只有单体的actin，也就是G-actin。