科研指南
Research Guide
01
偶联与纯化试剂盒
什么是抗体纯化试剂盒，具体有什么作用？
可以快速去除抗体储存液中的BSA、甘油、叠氮钠、tris等等，同时可以纯化血清或者腹水粗提的抗体
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 未纯化的组织培养上清（TSC）来源的抗体
小鼠源抗体: ab128749 mouse TCS Purification System
兔或人源抗体：ab109207 antibody TCS Purificati
可纯化5mg抗体 （10-50ml）
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 未纯化的血清或腹水来源的抗体
Protein A Antibody serum purification kit: ab109209
Protein G Antibody serum purification kit: ab128751
可纯化10-20mg抗体
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 纯化后的抗体
小鼠源抗体：ab128745 Mouse Antibody Purification Kit
兔来源抗体：ab102784 Antibody Purification Kit (Protein A)
大鼠、山羊或人来源抗体：ab128747 Antibody Purification Kit (Protein G)
可纯化0.5 mg抗体 （100-500µl）
如何快速去除纯化抗体储存液中含有的BSA？
BSA Removal Kit (ab173231)可去除1.5ml抗体中浓度不高于0.5%的BSA
不限制抗体的种属与亚型
使用抗体偶联试剂盒最佳抗体起始浓度是多少？
1-4mg/ml浓度的抗体可以达到最佳效果， 0.5mg/ml是推荐的最小浓度
除了抗体以外，偶联试剂盒可以作用于其他蛋白吗？
理论上只要蛋白序列中有赖氨酸就可以用来偶联，但是偶联的比例需要根据蛋白分子量调整。
具体换算：比如是抗体½质量的蛋白 (e.g., 70 kDa)，偶联的蛋白浓度同样要减半
偶联试剂盒对抗体种属或者亚型是否有要求 没有，都兼容偶联后的抗体稳定性有多久？
抗体与偶联物以共价键方式结合，保证了长时间的稳定性Covalent conjugation ensures long term stability (18月 4℃ 或者 -20℃ 于甘油中，可储存2两)。
偶联后的稳定性很大程度上是依赖于抗体本身的。
偶联后的抗体是否会发生聚集？
不会
是否需要特异去除未偶联的荧光素？
不需要，kit中配的Quencher 会特异阻断偶联物中的活性基团
对于偶联试剂盒而言，什么样的抗体储存液是合适的？
Hepes, MES, MOPS 以及磷酸缓冲液或者不含自由氨基的溶液；
Tris的浓度不能高于20mM；
pH 建议范围为：6.5 - 8.5
抗体储存液中哪些添加物对于偶联试剂盒是不兼容的？
• Tris above 20mM
• Urea
• 50mM Imidazole
• Glycine
• Ethanolamine
• DTT
• Mercaptoethanol
• Other thiols
叠氮钠是否会对偶联效率造成影响？
叠氮钠会对偶联造成一定影响。对于荧光偶联试剂盒而言，叠氮钠最高浓度不能超过 0.1%。
叠氮钠会不可逆的抑制HRP，因此对于HRP偶联试剂盒而言，不能有叠氮钠。
BSA与明胶是否影响偶联效率？
理论上，浓度小于0.1%的BSA与明胶对偶联的影响不大。
如何特异去除不兼容的组分？
可以选择抗体纯化试剂盒
偶联后的抗体是否需要进行脱盐处理？
不需要，可以直接使用。
Biotin偶联试剂盒分为： Biotin(type A) Conjugation Kit(ab102865) 以及Biotin (type B)Conjugation Kit (ab102867)，它们之间有什么区别？
工作原理是一样的，后续都可以使用在WB, ELISA, IHC等试验中。
区别在于Biotin的量不同，Biotin A kit会有额外的没有偶联的自由Biotin,而Biotin B kit 更多的是偶联的形式。
因此Biotin B kit更适合与固定在板子上或膜上的streptavidin结合的实验范式 (可用竞争法)； Biotin A kit 更适合后续去结合streptavidin-HRP的实验范式(间接法或夹心法可用)。A 更常用。
胶体金标记原理以及颗粒大小的选择：
胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。
在免疫金银染色法中，度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的胶体金比大颗粒胶体金能吸附更多的银离子，而且小颗粒胶体金比大颗粒胶体金更为稳定。所以，在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒更为稳定。所以在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒也较小。
关于kit Calcineurin Phosphatase(ab139461)原理
钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是迄今所知的惟一一种受Ca~(2+)/钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN广泛分布于机体内各种组织中,参与多种受Ca~(2+)调节的信号转导通路,并通过作用于不同的底物而产生不同的生物学效应。
在细胞信号传递的过程中，CN被Ca和钙调素（CaM）激活后，通过对靶蛋白NFAT的脱磷酸化而实现对生理活动的调节。
标准曲线 标定浓度关系
time course 曲线，找线性范围
ab27551 链接几个biotin
there are 3-8 biotin molecules at each immunoglobulin molecule. The means of conjugation, however, are proprietary information.
可以快速去除抗体储存液中的BSA、甘油、叠氮钠、tris等等，同时可以纯化血清或者腹水粗提的抗体
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 未纯化的组织培养上清（TSC）来源的抗体
小鼠源抗体: ab128749 mouse TCS Purification System
兔或人源抗体：ab109207 antibody TCS Purificati
可纯化5mg抗体 （10-50ml）
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 未纯化的血清或腹水来源的抗体
Protein A Antibody serum purification kit: ab109209
Protein G Antibody serum purification kit: ab128751
可纯化10-20mg抗体
如何根据样本选择对应的纯化试剂盒 -- 纯化后的抗体
小鼠源抗体：ab128745 Mouse Antibody Purification Kit
兔来源抗体：ab102784 Antibody Purification Kit (Protein A)
大鼠、山羊或人来源抗体：ab128747 Antibody Purification Kit (Protein G)
可纯化0.5 mg抗体 （100-500µl）
如何快速去除纯化抗体储存液中含有的BSA？
BSA Removal Kit (ab173231)可去除1.5ml抗体中浓度不高于0.5%的BSA
不限制抗体的种属与亚型
使用抗体偶联试剂盒最佳抗体起始浓度是多少？
1-4mg/ml浓度的抗体可以达到最佳效果， 0.5mg/ml是推荐的最小浓度
除了抗体以外，偶联试剂盒可以作用于其他蛋白吗？
理论上只要蛋白序列中有赖氨酸就可以用来偶联，但是偶联的比例需要根据蛋白分子量调整。
具体换算：比如是抗体½质量的蛋白 (e.g., 70 kDa)，偶联的蛋白浓度同样要减半
偶联试剂盒对抗体种属或者亚型是否有要求 没有，都兼容偶联后的抗体稳定性有多久？
抗体与偶联物以共价键方式结合，保证了长时间的稳定性Covalent conjugation ensures long term stability (18月 4℃ 或者 -20℃ 于甘油中，可储存2两)。
偶联后的稳定性很大程度上是依赖于抗体本身的。
偶联后的抗体是否会发生聚集？
不会
是否需要特异去除未偶联的荧光素？
不需要，kit中配的Quencher 会特异阻断偶联物中的活性基团
对于偶联试剂盒而言，什么样的抗体储存液是合适的？
Hepes, MES, MOPS 以及磷酸缓冲液或者不含自由氨基的溶液；
Tris的浓度不能高于20mM；
pH 建议范围为：6.5 - 8.5
抗体储存液中哪些添加物对于偶联试剂盒是不兼容的？
• Tris above 20mM
• Urea
• 50mM Imidazole
• Glycine
• Ethanolamine
• DTT
• Mercaptoethanol
• Other thiols
叠氮钠是否会对偶联效率造成影响？
叠氮钠会对偶联造成一定影响。对于荧光偶联试剂盒而言，叠氮钠最高浓度不能超过 0.1%。
叠氮钠会不可逆的抑制HRP，因此对于HRP偶联试剂盒而言，不能有叠氮钠。
BSA与明胶是否影响偶联效率？
理论上，浓度小于0.1%的BSA与明胶对偶联的影响不大。
如何特异去除不兼容的组分？
可以选择抗体纯化试剂盒
偶联后的抗体是否需要进行脱盐处理？
不需要，可以直接使用。
Biotin偶联试剂盒分为： Biotin(type A) Conjugation Kit(ab102865) 以及Biotin (type B)Conjugation Kit (ab102867)，它们之间有什么区别？
工作原理是一样的，后续都可以使用在WB, ELISA, IHC等试验中。
区别在于Biotin的量不同，Biotin A kit会有额外的没有偶联的自由Biotin,而Biotin B kit 更多的是偶联的形式。
因此Biotin B kit更适合与固定在板子上或膜上的streptavidin结合的实验范式 (可用竞争法)； Biotin A kit 更适合后续去结合streptavidin-HRP的实验范式(间接法或夹心法可用)。A 更常用。
胶体金标记原理以及颗粒大小的选择：
胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。
在免疫金银染色法中，度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的胶体金比大颗粒胶体金能吸附更多的银离子，而且小颗粒胶体金比大颗粒胶体金更为稳定。所以，在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒更为稳定。所以在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒也较小。
关于kit Calcineurin Phosphatase(ab139461)原理
钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是迄今所知的惟一一种受Ca~(2+)/钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN广泛分布于机体内各种组织中,参与多种受Ca~(2+)调节的信号转导通路,并通过作用于不同的底物而产生不同的生物学效应。
在细胞信号传递的过程中，CN被Ca和钙调素（CaM）激活后，通过对靶蛋白NFAT的脱磷酸化而实现对生理活动的调节。
标准曲线 标定浓度关系
time course 曲线，找线性范围
ab27551 链接几个biotin
there are 3-8 biotin molecules at each immunoglobulin molecule. The means of conjugation, however, are proprietary information.