科研指南
Research Guide
01
IHC常见问题答疑
免疫荧光选择直标一抗
建议使用直标一抗：不需要选择不同宿主来源的抗体；不需要使用二抗；小鼠样本可以使用小鼠一抗
石蜡切片可以做免疫荧光么？
醛类固定剂可能会与抗体结合造成高背景，一般不建议PFA固定石蜡切片使用免疫荧光
如果要使用，建议增加阴性对照组（不加一抗只加二抗），并使用0.3M甘氨酸进行封闭
抗原修复液的选择：
通常采用热修复的方法，除非datasheet指明用酶修复；热修复citrate buffer以及EDTA/Tris都是常规的修复方法；
1. 柠檬酸钠缓冲液(10 mM Sodium Citrate, 0.05% 吐温- 20, pH 6.0)
2. 1 mM EDTA, 调至pH 8.0
3. Tris/EDTA 缓冲液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% 吐温-20, pH 9.0)
冰冻切片需要抗原修复么？
一般不进行抗原修复，如需要建议使用酶抗原修复方法
需要通透么？
石蜡切片一般 3-5 um，不需要通透。
冰冻切片一般 10-30 um，需要通透步骤。
封闭液的选择：
建议使用10%血清（二抗宿主来源），也可以使用 BSA。
抗体标记物的相应封闭条件
HRP: 在含0.3% H2O2 的TBS或甲醇（甲醇更适合于血涂片或其它富含过氧化物酶的组织如肝脏）中孵育15分钟。
AP: 取0.24mg/ml的左旋四咪唑加到染料溶液中。
Biotin: 封闭试剂盒 Endogenous Avidin + Biotin Blocking System （ab3387）
荧光标记物（PFA固定）：用含0.3M 甘氨酸的封闭液封闭
对照设置
同型对照：相同宿主来源相同亚型无靶标的抗体，评价非特异性交叉反应和 Fc 受体结合影响。
阴性对照：只加二抗不加一抗（如果无同型对照可以选择阴性对照）。
阳性对照：高表达该靶标蛋白的组织样品。
有阳性对照么 很抱歉我们不能提供阳性切片，您可以参考网站：http://www.proteinatlas.org/
这个网站是人源样本石蜡切片染色结果的数据库
小鼠样本可以使用大鼠二抗么？
可以，选择经过预吸附处理的二抗
例如：Goat Anti-Rat IgG H&L (HRP) preadsorbed (ab7097)， Minimal cross-reactivity with Mouse
小鼠样本可以使用小鼠二抗么？
抗小鼠的二抗不但会识别小鼠一抗，同时也会识别小鼠样本中的内源IgG,因此可能造成高背景
如果一定要用小鼠一抗，选择显色试剂盒：Mouse on Mouse Polymer IHC Kit (ab127055)
一抗的稀释比例：
建议参考说明书中推荐稀释比例建立浓度梯度预实验，选择最适合的稀释比例。
如果没有推荐浓度，建议1:50/100/200 浓度梯度预实验
为什么选择显色试剂盒？
信号放大、降低背景（信号更强更特异）
操作简便，可重复性强
怎样选择显色试剂盒？
可以选择 Rabbit specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit (ab64261)
如果是检测内源生物素较高的组织（肾脏、肝脏、大脑等），可以选择不含生物素的检测试剂盒（biotin free）EXPOSE Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC kit (ab80436)
免疫化学可以双染么？
可以，使用不同种属来源的一抗，不同标记物的二抗
例如大鼠一抗和兔一抗可以选择试剂盒 DoubleStain IHC Kit: R&Rt on human/mouse tissue (Green/HRP &AP/Red) (ab183285)
使用biotin标记的一抗或二抗时，怎么样进行后续实验？
免疫化学：
Streptavidin HRP (ab7403)
Streptavidin Peroxidase (Ready to Use) (ab64269)
Streptavidin Alkaline Phosphatase (Ready to Use) (ab64268)
免疫荧光：
Streptavidin full length protein (ab134349) DyLight® 488. Ex: 493nm, Em: 518nm
Streptavidin full length protein (ab134348) DyLight® 550. Ex: 562nm, Em: 576nm
Streptavidin full length protein (ab134341) DyLight® 650. Ex: 654nm, Em: 673nm
常用的显色底物
HRP:
DAB Substrate Kit (ab64238)
AEC Substrate System (Ready to Use) (ab64252)
AP:
Alkaline Phosphatase chromogen (BCIP/NBT) - Ready to Use (ab7468)
StayGreen/AP (Alcohol and Xylene Substitute Compatible) (ab156428)
StayRed/AP 30ml (Alcohol & Xylene Compatible) (ab103741)
StayBlue/AP 30ml (Alcohol and Xylene Substitute Compatible) (ab178453)
增强显色液
HRP:
Steady DAB/Plus (200ml) (ab103723)
AEC Single/Plus (30ml) (ab103742)
AP:
StayBlue/AP Plus (ab176915)
核染料
Mayer's Hematoxylin (ab128990) 蓝紫色，免疫化学染核
DRAQ5™ (5mM) (ab108410) 红色，免疫荧光染核，活细胞和固定细胞都可以染
DRAQ7™ 1ml (0.3mM) (ab109202) 红色，免疫荧光染核，染死细胞和通透化细胞
常见的特异染料
染铁：Iron Stain (ab150674)
染钙：Von Kossa (Calcium Stain) (ab150687)
染脂肪：Oil Red O (Lipid Stain) (ab150678)
染血细胞：Giemsa (Hematologic and Microorganism Stain) (ab150670)
怎么观察细胞形态？
建议对相邻的连续切片进行 HE 染色（苏木精 — 伊红染色）。
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色
高背景
观察阴性对照（只加二抗不加一抗）
如果阴性对照背景高：优化封闭条件（血清封闭，增加封闭时间，根据抗体标记物进行相应封闭）；优化抗原修复条件（更换抗体修复液，减少抗原修复时间）；优化二抗（使用预吸附处理的二抗）
如果阴性对照背景不高：优化一抗孵育条件（增加一抗稀释比例，减少一抗孵育时间）
无阳性信号
观察阳性对照
如果阳性对照有染色信号，则样本中不表达抗原或抗原被破坏；
如果阳性对照有信号：优化抗原修复条件（更换抗原修复液，缩短抗原修复时间）；优化一抗孵育条件（增加一抗工作浓度，增加一抗孵育时间）；信号放大（使用增强型显色液；使用显色试剂盒：生物素-亲和素/多聚酶信号放大）
错误染色
错误的细胞染色或错误的亚细胞定位
使用WB检测抗体特异性：单一条带特异性好，杂带多特异性较差。
使用 RNAi 或 KO 实验模型检测条带没有差异则抗体不特异。
免疫组化没有阳性通常做哪些实验改进？
1：样本固定时间一般在18-24h；
2：设置不同抗原修复时间的平行；
3：提高一抗浓度；
4：二抗是否匹配？
5：是否尝试信号放大；
化学显色做三标记
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Glucose Oxidase)
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6721)
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alkaline Phosphatase) (ab6886)
建议使用直标一抗：不需要选择不同宿主来源的抗体；不需要使用二抗；小鼠样本可以使用小鼠一抗
石蜡切片可以做免疫荧光么？
醛类固定剂可能会与抗体结合造成高背景，一般不建议PFA固定石蜡切片使用免疫荧光
如果要使用，建议增加阴性对照组（不加一抗只加二抗），并使用0.3M甘氨酸进行封闭
抗原修复液的选择：
通常采用热修复的方法，除非datasheet指明用酶修复；热修复citrate buffer以及EDTA/Tris都是常规的修复方法；
1. 柠檬酸钠缓冲液(10 mM Sodium Citrate, 0.05% 吐温- 20, pH 6.0)
2. 1 mM EDTA, 调至pH 8.0
3. Tris/EDTA 缓冲液(10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% 吐温-20, pH 9.0)
冰冻切片需要抗原修复么？
一般不进行抗原修复，如需要建议使用酶抗原修复方法
需要通透么？
石蜡切片一般 3-5 um，不需要通透。
冰冻切片一般 10-30 um，需要通透步骤。
封闭液的选择：
建议使用10%血清（二抗宿主来源），也可以使用 BSA。
抗体标记物的相应封闭条件
HRP: 在含0.3% H2O2 的TBS或甲醇（甲醇更适合于血涂片或其它富含过氧化物酶的组织如肝脏）中孵育15分钟。
AP: 取0.24mg/ml的左旋四咪唑加到染料溶液中。
Biotin: 封闭试剂盒 Endogenous Avidin + Biotin Blocking System （ab3387）
荧光标记物（PFA固定）：用含0.3M 甘氨酸的封闭液封闭
对照设置
同型对照：相同宿主来源相同亚型无靶标的抗体，评价非特异性交叉反应和 Fc 受体结合影响。
阴性对照：只加二抗不加一抗（如果无同型对照可以选择阴性对照）。
阳性对照：高表达该靶标蛋白的组织样品。
有阳性对照么 很抱歉我们不能提供阳性切片，您可以参考网站：http://www.proteinatlas.org/
这个网站是人源样本石蜡切片染色结果的数据库
小鼠样本可以使用大鼠二抗么？
可以，选择经过预吸附处理的二抗
例如：Goat Anti-Rat IgG H&L (HRP) preadsorbed (ab7097)， Minimal cross-reactivity with Mouse
小鼠样本可以使用小鼠二抗么？
抗小鼠的二抗不但会识别小鼠一抗，同时也会识别小鼠样本中的内源IgG,因此可能造成高背景
如果一定要用小鼠一抗，选择显色试剂盒：Mouse on Mouse Polymer IHC Kit (ab127055)
一抗的稀释比例：
建议参考说明书中推荐稀释比例建立浓度梯度预实验，选择最适合的稀释比例。
如果没有推荐浓度，建议1:50/100/200 浓度梯度预实验
为什么选择显色试剂盒？
信号放大、降低背景（信号更强更特异）
操作简便，可重复性强
怎样选择显色试剂盒？
可以选择 Rabbit specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit (ab64261)
如果是检测内源生物素较高的组织（肾脏、肝脏、大脑等），可以选择不含生物素的检测试剂盒（biotin free）EXPOSE Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC kit (ab80436)
免疫化学可以双染么？
可以，使用不同种属来源的一抗，不同标记物的二抗
例如大鼠一抗和兔一抗可以选择试剂盒 DoubleStain IHC Kit: R&Rt on human/mouse tissue (Green/HRP &AP/Red) (ab183285)
使用biotin标记的一抗或二抗时，怎么样进行后续实验？
免疫化学：
Streptavidin HRP (ab7403)
Streptavidin Peroxidase (Ready to Use) (ab64269)
Streptavidin Alkaline Phosphatase (Ready to Use) (ab64268)
免疫荧光：
Streptavidin full length protein (ab134349) DyLight® 488. Ex: 493nm, Em: 518nm
Streptavidin full length protein (ab134348) DyLight® 550. Ex: 562nm, Em: 576nm
Streptavidin full length protein (ab134341) DyLight® 650. Ex: 654nm, Em: 673nm
常用的显色底物
HRP:
DAB Substrate Kit (ab64238)
AEC Substrate System (Ready to Use) (ab64252)
AP:
Alkaline Phosphatase chromogen (BCIP/NBT) - Ready to Use (ab7468)
StayGreen/AP (Alcohol and Xylene Substitute Compatible) (ab156428)
StayRed/AP 30ml (Alcohol & Xylene Compatible) (ab103741)
StayBlue/AP 30ml (Alcohol and Xylene Substitute Compatible) (ab178453)
增强显色液
HRP:
Steady DAB/Plus (200ml) (ab103723)
AEC Single/Plus (30ml) (ab103742)
AP:
StayBlue/AP Plus (ab176915)
核染料
Mayer's Hematoxylin (ab128990) 蓝紫色，免疫化学染核
DRAQ5™ (5mM) (ab108410) 红色，免疫荧光染核，活细胞和固定细胞都可以染
DRAQ7™ 1ml (0.3mM) (ab109202) 红色，免疫荧光染核，染死细胞和通透化细胞
常见的特异染料
染铁：Iron Stain (ab150674)
染钙：Von Kossa (Calcium Stain) (ab150687)
染脂肪：Oil Red O (Lipid Stain) (ab150678)
染血细胞：Giemsa (Hematologic and Microorganism Stain) (ab150670)
怎么观察细胞形态？
建议对相邻的连续切片进行 HE 染色（苏木精 — 伊红染色）。
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色
高背景
观察阴性对照（只加二抗不加一抗）
如果阴性对照背景高：优化封闭条件（血清封闭，增加封闭时间，根据抗体标记物进行相应封闭）；优化抗原修复条件（更换抗体修复液，减少抗原修复时间）；优化二抗（使用预吸附处理的二抗）
如果阴性对照背景不高：优化一抗孵育条件（增加一抗稀释比例，减少一抗孵育时间）
无阳性信号
观察阳性对照
如果阳性对照有染色信号，则样本中不表达抗原或抗原被破坏；
如果阳性对照有信号：优化抗原修复条件（更换抗原修复液，缩短抗原修复时间）；优化一抗孵育条件（增加一抗工作浓度，增加一抗孵育时间）；信号放大（使用增强型显色液；使用显色试剂盒：生物素-亲和素/多聚酶信号放大）
错误染色
错误的细胞染色或错误的亚细胞定位
使用WB检测抗体特异性：单一条带特异性好，杂带多特异性较差。
使用 RNAi 或 KO 实验模型检测条带没有差异则抗体不特异。
免疫组化没有阳性通常做哪些实验改进？
1：样本固定时间一般在18-24h；
2：设置不同抗原修复时间的平行；
3：提高一抗浓度；
4：二抗是否匹配？
5：是否尝试信号放大；
化学显色做三标记
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Glucose Oxidase)
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6721)
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alkaline Phosphatase) (ab6886)