科研指南

针对同一指标的两个一抗能否在sELISA中配对使用？
双抗夹心ELISA要求配对的包被抗体和检测抗体能够检测抗原的不同表位，不会干扰彼此与抗原的结合，因此要做很多筛选才能确定两个抗体是否可以在sELISA中配对使用；因此需要abcam 验证过确实可以用于sELISA;

ELISA实验中的样品如何稀释？
不同的样本需要做不同的优化；可以预计样品中大致的浓度范围会更好，如果不知道，建议准备几个稀释比例，例如 1:2,1:10, and 1:100；

间接ELISA中重组蛋白作为包被抗原的用量是多少？
1）重组蛋白或者免疫原peptide一般200ng/well；用PBS或者磷酸盐缓冲液稀释；推荐用0.1M NaHCO3（pH8.2）；
2）纯度不高的样品一般20ug/ml；
3）纯度较高的样品不低于2ug/ml；

包被抗原孵育时间？
一般室温2h或者4度过夜；

封闭后推荐洗涤次数？
建议PBST(0.2%twee-20)洗涤2-4次。

一抗孵育后推荐洗涤次数？
建议PBST(0.2%twee-20)洗涤4-6次。

二抗孵育后推荐洗涤次数？
建议PBST(0.2%twee-20)洗涤。

ELISA实验中常用的底物有哪些？
AP常用的底物是pNPP；
HRP常用底物是：
（1）TMB，孵育15-30分钟后加终止液，450nm读OD值；
（2）OPD:光敏感，避光保存；492nm下检测；
（3）ABTS：产物是绿色，416nm读OD值；

ELISA中coefficient of variation (CV)值较高可能的原因是什么？
1）well里是否有气泡；读板前确认well里没有气泡；
2）well是否洗涤彻底；
3）所有试剂是否彻底混匀；
4）移液器每次取液是否一致；使用校对过的移液器保证准确取样；
5）边缘效应；保证plate和所有试剂都在室温：
6）样本准备或者保存条件是否一致？应尽量较少样本的反复冻融；

如何收集血浆样本？
1）在含有抗凝剂的抗凝管（例如BDVacutainer Coagulationtubes (Cat #: 363080/363080)）中收集全血；或者加入0.1 Msodium citrate 到 1/10终体积里；
2) 4度下3,000rpm离心10mins；
3)离心后的上清立即分装后保存在-80度，避免反复冻融；

如何收集血清样本？
1）在无抗凝剂的抗凝管（例如BD Vacutainer Serum tubes(Cat #: 367812)）中收集全血；
2）室温下自然放置20mins；
3) 4度下3,000rpm离心10mins；
3)离心后的上清立即分装后保存在-80度，避免反复冻融；

关于kit标准曲线作图
如何做kit标准曲线的log-log 图？直接将横纵坐标改为log10的单位即可

kit中标准曲线的函数一般选什么？
一般有两种，线性与非线性。非线性一般我们推荐四参数或者多参数作图。四参数可以使用软件origin pro/graphpad prism等软件

说明书应用那栏中标注的是ELISA，是否可以做夹心ELISA试验？
说明书中的ELISA特指间接法ELISA，只有标注sELISA的抗体，我们才验证过夹心ELISA试验

关于sELISA抗体对的选择
1）application 中是否带sELISA
2) 种属不同
3) 带标签否
4) 推荐HRP-conjugation kit