科研指南
Research Guide
01
ICC常见问题解答
细胞免疫荧光实验可以选择什么样的固定剂？
最常用的两类：醛类固定剂PFA等，个别抗体不适合
有机溶剂固定，丙酮、甲醇、乙醇等。有通透效果，膜蛋白检测不首选
是否需要对样本进行通透处理？ 胞浆蛋白、核蛋白以及抗原决定簇在胞内的膜蛋白需要进行通透性处理性处理
细胞免疫荧光实验常用的封闭液有哪些？ 二抗宿主来源血清（5-10%）或者BSA（5%）
细胞免疫荧光实验中一抗孵育的浓度与时间的参数分别是什么？
浓度：参照说明书中建议的浓度点，做平行梯度实验
时间：首选室温1h，如果信号非常弱，可适度延长孵育时间
如何判断染色得到的亚细胞定位是否正确？
通过文献检索：http://www.proteinatlas.org/
通过数据库检索：http://biogps.org/
活细胞抗体染色的注意事项有哪些？
目标蛋白必须是抗原表位在胞外的膜蛋白
抗体储存液中不能含有叠氮钠或其他防腐剂
实验要在4℃条件下操作
细胞成像试验中直标一抗有哪些优势？
多标试验中，减少了交叉反应，降低背景信号
多标试验中，一抗不需要来源于不同宿主，极大拓宽了抗体的可选范围
可以做组化的抗体是否一定可以检测细胞免疫荧光实验？
虽然原理相似，但是如果说明书中没有标注则不在质保范围内
什么样的荧光素适合成像实验？
就细胞成像实验而言，建议选择Dylight或者Alex Fluor系类荧光素，保证在长时间的成像试验中依旧可以保持光明亮度以及抗淬灭的能力
多色标记时的荧光素的搭配选择有哪些？
可参考搭配：紫外通道/Alex Fluor488[FITC]/Alex Fluor555[TRITC]/Alex Fluor 594[Texas Red ]/Alex Fluor647[Cy5]
某些荧光二抗会标注“preadsorbed”，有什么什么特殊含义？
标注“preadsorbed”的二抗意味着在抗体纯化的过程中额外多了一个流程，除去了会与其他物种交叉反应的组分，对于多色标记是非常合适的工具
如果靶细胞或者目标蛋白有自发荧光现象，该如何避免干扰目的信号？
可以选择波长比较长的荧光二抗，如Alex Fluor647等，因为自发荧光往往波长比较段
细胞免疫荧光实验没有阳性信号怎么办？
增加阳性对照
缩短固定时间、更换固定剂
增加一抗孵育浓度与时间
确认通透处理条件是否恰当
细胞免疫荧光实验出现高背景染色怎么办？
确认封闭是否彻底
调整一抗浓度
不加一抗，做二抗的阴性对照
洗涤液中加0.2%Tween
若样本经PFA等醛类固定剂处理，封闭液中加入0.3M甘氨酸
细胞免疫荧光实验出现错误染色怎么办？
使用阴性对照样本确认抗体特异性
更换固定剂
染色期间务必要避免细胞干燥，因为这可能引起假阳性
用WB实验进一步确认抗体特异性
针对不同细胞组分的快速标记方法有哪些？
使用细胞器或者细胞组分特异的荧光染料，比如Cytopainter系列产品
Cytopainter等荧光染料比起抗体而言有哪些特点？
操作更便捷、无种属限制、避免了抗原抗体间可能的非特异结合
Cytopainter亚细胞荧光染料是否活细胞与固定后的细胞都适合？
Cytopainter: 核染料适用于活细胞
F-actin染料，Phalloidin，适用于固定后细胞
除此之外都是通用的 （Mitochondria/lysosomes）染色后细胞可进一步固定
Cytopainter产品有试剂也有kit，比如：CytoPainter Phalloidin-iFluor 488Reagent (ab176753)与 CytoPainter Factin Staining Kit - GreenFluorescence (ab112125) 有什么区别？
针对Actin filaments, mitochondria and lysosomal的Cytopainter产品可以选择试剂盒也可以单独订购染料，一般有经验的客户可以推荐染料（更容易调整protocol），新手推荐使用kit(操作起来更流程化)
CytoPainter染色效果弱怎么办？
针对不同的细胞类型，优化染料孵育时间与浓度使用醛类固定剂，不适用甲醇等固定剂。
某些CytoPainter产品标注Ex:405，比如：CytoPainter MitoOrange 405 IndicatorReagent (ab176834)，是否可以与DAPI共标？
可以。这类产品Ex/Em = 399/550 nm，因此与DPAI可以共用一个激光器，但是颜色表现为橙黄色。
免疫细胞化学染色定位不对怎么办？
尝试不同的固定方法，例如4%PFA改为预冷的甲醇或丙酮固定；
膜蛋白是否需要破膜处理？
需要看表位是否在膜外，细胞膜中，或者胞内。
具体查询的方法:
1. SwissProt: P06731 Human
2. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 【邮件中介绍的软件】
关于confocal的激光器与荧光选择
最常见的配置：
激光器：405激光器，为半导体激光器, 激光波长405nm；
氩离子激光器的激光输出波长有458nm, 476nm,488nm和514nm；
543激光器为氦氖气体激光器, 激光波长543nm；
[543nm 的激光可以用在alexa594]
633激光器的激发波长为633nm；
詹纳斯绿 Janus Green B
詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。
【原理】线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。
最常用的两类：醛类固定剂PFA等，个别抗体不适合
有机溶剂固定，丙酮、甲醇、乙醇等。有通透效果，膜蛋白检测不首选
是否需要对样本进行通透处理？ 胞浆蛋白、核蛋白以及抗原决定簇在胞内的膜蛋白需要进行通透性处理性处理
细胞免疫荧光实验常用的封闭液有哪些？ 二抗宿主来源血清（5-10%）或者BSA（5%）
细胞免疫荧光实验中一抗孵育的浓度与时间的参数分别是什么？
浓度：参照说明书中建议的浓度点，做平行梯度实验
时间：首选室温1h，如果信号非常弱，可适度延长孵育时间
如何判断染色得到的亚细胞定位是否正确？
通过文献检索：http://www.proteinatlas.org/
通过数据库检索：http://biogps.org/
活细胞抗体染色的注意事项有哪些？
目标蛋白必须是抗原表位在胞外的膜蛋白
抗体储存液中不能含有叠氮钠或其他防腐剂
实验要在4℃条件下操作
细胞成像试验中直标一抗有哪些优势？
多标试验中，减少了交叉反应，降低背景信号
多标试验中，一抗不需要来源于不同宿主，极大拓宽了抗体的可选范围
可以做组化的抗体是否一定可以检测细胞免疫荧光实验？
虽然原理相似，但是如果说明书中没有标注则不在质保范围内
什么样的荧光素适合成像实验？
就细胞成像实验而言，建议选择Dylight或者Alex Fluor系类荧光素，保证在长时间的成像试验中依旧可以保持光明亮度以及抗淬灭的能力
多色标记时的荧光素的搭配选择有哪些？
可参考搭配：紫外通道/Alex Fluor488[FITC]/Alex Fluor555[TRITC]/Alex Fluor 594[Texas Red ]/Alex Fluor647[Cy5]
某些荧光二抗会标注“preadsorbed”，有什么什么特殊含义？
标注“preadsorbed”的二抗意味着在抗体纯化的过程中额外多了一个流程，除去了会与其他物种交叉反应的组分，对于多色标记是非常合适的工具
如果靶细胞或者目标蛋白有自发荧光现象，该如何避免干扰目的信号？
可以选择波长比较长的荧光二抗，如Alex Fluor647等，因为自发荧光往往波长比较段
细胞免疫荧光实验没有阳性信号怎么办？
增加阳性对照
缩短固定时间、更换固定剂
增加一抗孵育浓度与时间
确认通透处理条件是否恰当
细胞免疫荧光实验出现高背景染色怎么办？
确认封闭是否彻底
调整一抗浓度
不加一抗，做二抗的阴性对照
洗涤液中加0.2%Tween
若样本经PFA等醛类固定剂处理，封闭液中加入0.3M甘氨酸
细胞免疫荧光实验出现错误染色怎么办？
使用阴性对照样本确认抗体特异性
更换固定剂
染色期间务必要避免细胞干燥，因为这可能引起假阳性
用WB实验进一步确认抗体特异性
针对不同细胞组分的快速标记方法有哪些？
使用细胞器或者细胞组分特异的荧光染料，比如Cytopainter系列产品
Cytopainter等荧光染料比起抗体而言有哪些特点？
操作更便捷、无种属限制、避免了抗原抗体间可能的非特异结合
Cytopainter亚细胞荧光染料是否活细胞与固定后的细胞都适合？
Cytopainter: 核染料适用于活细胞
F-actin染料，Phalloidin，适用于固定后细胞
除此之外都是通用的 （Mitochondria/lysosomes）染色后细胞可进一步固定
Cytopainter产品有试剂也有kit，比如：CytoPainter Phalloidin-iFluor 488Reagent (ab176753)与 CytoPainter Factin Staining Kit - GreenFluorescence (ab112125) 有什么区别？
针对Actin filaments, mitochondria and lysosomal的Cytopainter产品可以选择试剂盒也可以单独订购染料，一般有经验的客户可以推荐染料（更容易调整protocol），新手推荐使用kit(操作起来更流程化)
CytoPainter染色效果弱怎么办？
针对不同的细胞类型，优化染料孵育时间与浓度使用醛类固定剂，不适用甲醇等固定剂。
某些CytoPainter产品标注Ex:405，比如：CytoPainter MitoOrange 405 IndicatorReagent (ab176834)，是否可以与DAPI共标？
可以。这类产品Ex/Em = 399/550 nm，因此与DPAI可以共用一个激光器，但是颜色表现为橙黄色。
免疫细胞化学染色定位不对怎么办？
尝试不同的固定方法，例如4%PFA改为预冷的甲醇或丙酮固定；
膜蛋白是否需要破膜处理？
需要看表位是否在膜外，细胞膜中，或者胞内。
具体查询的方法:
1. SwissProt: P06731 Human
2. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 【邮件中介绍的软件】
关于confocal的激光器与荧光选择
最常见的配置：
激光器：405激光器，为半导体激光器, 激光波长405nm；
氩离子激光器的激光输出波长有458nm, 476nm,488nm和514nm；
543激光器为氦氖气体激光器, 激光波长543nm；
[543nm 的激光可以用在alexa594]
633激光器的激发波长为633nm；
詹纳斯绿 Janus Green B
詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。
【原理】线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。